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%DOKUMENTENANFANG
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\begin{document}
\sloppy
%TITELSEITE
\begin{titlepage}
\normalsize
Tobias Lübke \\
Matrikel-Nummer: XXXXXX\\
\vspace*{3cm}
\begin{center}
\huge
Produktion von biotinylierten Antikörperfragmenten für den Einsatz in der
Diagnostik\\
\vspace{2cm}
\large
Masterarbeit zur Erlangung des akademischen Grades \\
Master of Science (B.Sc.) \\
\vspace{2cm}
im Studiengang \\
Biotechnologie \\
an der \\
Hochschule Anhalt (FH) \\
Fachbereich Angewandte Biowissenschaften und Prozesstechnik \\
\vspace{2cm}
eingereicht am: 12.06.2008
\end{center}
\normalsize
\vfill
1. Prüfer: Herr Prof. Dr. Hans-Jürgen Mägert \\
2. Prüfer: Herr Prof. Dr. Ulrich Junghannß\\
\end{titlepage}
\setcounter{page}{1}
\tableofcontents
\listoffigures
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\numberline{}Abbildungsverzeichnis}
\listoftables
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\numberline{}Tabellenverzeichnis}
\chapter*{Abkürzungsverzeichnis}
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\numberline{}Abkürzungsverzeichnis}
\begin{tabbing}
1234567890123456789012345 \= NAME \kill
A \> Absorption \\
AP \> Alkalische Phosphatase \\
APS \> Ammoniumpersulfat \\
BAD \> Biotin Akzeptor Domäne \\
BCIP \> 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoxylphosphat p-Toluidin Salz \\
BSA \> bovine serum albumine \\
CDR \> complementary determining regions \\
C\textsubscript{H} \> konstante Region der schweren Kette \\
C\textsubscript{L} \> konstante Region der leichten Kette \\
DF \> Durchfluss \\
dH\textsubscript{2}O \> deionisiertes Wasser \\
DNA \> desoxyribonucleiacid \\
dNTP \> Desoxynukleotidtriphosphat \\
E \> Elutionsfraktion \\
\textit{E. coli} \> \textit{Escherichia coli} \\
EDTA \> Ethylendiamintetraacetat \\
ELISA \> enzyme-linked immunosorbent assay \\
Fab \> fragment antigen binding \\
Fc \> fragment cristallizable \\
Fr1-4 \> Fragment 1-4 \\
Fv \> fragment variable \\
g \> Gramm \\
°C \> Grad Celsius \\
h \> Stunde \\
His \> Histidin \\
HRP \> horseradish peroxidase \\
IfSG \> Infekitonsschutzgesetz \\
Ig \> Immunoglobulin \\
IMAC \> Immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie \\
IPTG \> Isopropyl-\begin{math}\beta\end{math}-D-thiogalactopyranosid \\
K \> Lysin \\
kb \> Kilobasen \\
L \> Liter \\
LB \> Nährmedium nach Luria Bertani \\
LEW \> Lysis-Equilibration-Wash \\
M \> Molar \\
mL \> Milliliter \\
MompC \> Major outer membrane protein C \\
MompJ \> Major outer membrane protein J \\
{\textmu}g \> Mikrogramm \\
{\textmu}L \> Mikroliter \\
NBT \> Nitro-Blue Tetrazolium Chlorid \\
OD \> optische Dichte \\
PAGE \> Polyacrylamid Gelelektrophorese \\
PBS \> phosphate buffered saline \\
PCR \> polymerase chain reaction \\
pH \> pondus Hydrogenii \\
pmol \> pico mol \\
PPP \> Präparation periplasmatischer Proteine \\
RNase \> Ribonuklease \\
rpm \> rotations per minute \\
scFv \> single-chain fragment variable \\
SDS \> Sodiumdodecylsulfat \\
Tab. \> Tabelle \\
TAE \> Tris-Acetat-EDTA \\
TE \> Tris-EDTA \\
TEMED \> N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin \\
TFB \> transformationbuffer \\
TMB \> Tetramethylbenzidin \\
Tris \> 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol \\
ÜKS \> Überkopfschüttler \\
üN \> über Nacht \\
ÜS \> Überstand \\
V\textsubscript{H} \> variable Region der schweren Kette) \\
V\textsubscript{L} \> variable Region der leichten Kette) \\
(v/v) \> volume per volume \\
(w/v) \> weight per volume \\
W \> Waschfraktion \\
\end{tabbing}
\chapter{Zusammenfassung}
Aufgrund der seit Jahren steigenden Zahl von bakteriellen Darmerkrankungen
durch \textit{Salmonella} und \textit{Campylobacter} sowie geänderter
Rechtsvorschriften zur Vermeidung der Erregerausbreitung, sind
zuverlässige Testsysteme für den Nachweis einer Infektion nötig.
\textit{Salmonella} und \textit{Campylobacter} sind Gram-negative
Stäbchen. Sie treten beim Nutztier vor allem beim Schwein
und Geflügel auf. Der Verzehr von kontaminierten Fleisch löst beim Menschen
schwere Darm- und Durchfallerkrankungen aus.
Ein zuverlässiger Erregernachweis ist zur Zeit nur auf Kulturebene und mittels
PCR möglich. Der Nachweis von pathogenspezifischen Antikörpern aus Tierseren
mittels ELISA hingegen ist nicht zuverlässig, was einen Einsatz in der
Routinediagnostik verhindert.
Zum Erregernachweis soll nun kompetitiver ELISA etabliert werden.
Dazu wurden in Vorversuchen scFv-Fragmente gegen pathogenspezifische Antigene
von \textit{Salmonella} (OmpD) und \textit{Campylobacter} (MompC und MompJ)
isoliert und charakterisiert.
Für die effektive Nutzung des bereits etablierten ELISAs sollen die zur
Kompetition eingesetzten scFv-Fragmente biotinyliert werden. Dies ermöglicht
die Verkürzung des Tests durch den Nachweis mit Streptavidin HRP-Konjugat.
In dieser Arbeit wurden die isolierten Antikörperfragmente mit Hilfe der
Plasmide pOPE101-XP und pRARE3 in \textit{E. coli} exprimiert und \textit{in
vivo} biotinyliert. Die erfolgreiche Biotinylierung der Fragmente konnte
nachgewiesen werden. Außerdem wurde festgestellt, dass die BAD-Fusion einen
negativen Einfluss auf die Produktionsausbeute um den Faktor 30 ausübt. Die
Biotinylierungsrate lag bei allen produzierten Fragmenten bei 100 \%. Im
Titrations-ELISA wurde die Bindung von OmpD-spezifschen scFv-Fragmenten an das
Antigen erfolgreich überprüft. Ein Einfluss der BAD auf die Affinität zum
Antigen konnte nicht festgestellt werden.
\end{document} |
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